บ้านจอมยุทธ [เมนูหลัก]

[ ปิด ] ⇛ หน้าบ้าน ⇛ ห้องสมุด ⇛ ห้องร้อยบุปผา ⇛ ห้องนิจนิรันดร์ ⇛ หอพระไตร ⇛ สะพายเป้ แบกกล้อง ท่องโลก ⇛ ชุมนุมจอมยุทธ ⇛ e-book ⇛ สมุดเยี่ยม

ค้นหาข้อมูลจากบ้านจอมยุทธ คลิก!

วิทยาศาสตร์ ดาราศาสตร์ ฟิสิกส์ เคมี ชีววิทยา >>

เทคนิคทางอณูชีววิทยา

เทคนิคพื้นฐานทางอณูชีววิทยา
Electrophoresis
Paper electrophoresis และ Gel electrophoresis
การเคลื่อนย้าย DNA จากแผ่นวุ้นลงไปบนกระดาษ (DNA Blotting)
DNA Probe และ Hybridization
Restriction Endonuclease
การเพิ่มจำนวน DNA โดยวิธี PCR (Polymerase chain reaction)
เทคนิค DNA cloning
การเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA กับ cloning vector เพื่อให้ได้ recombinant DNA
การนำ recombinant DNA เข้าสู่ host cell (transformation)
การคัดเลือก clone ที่มี gene ที่ต้องการ
เทคนิคในการตรวจสอบ DNA (DNA identification)
เทคนิคในการหา DNA sequence
เทคนิคทางอณูชีววิทยาที่ให้ผลผลิตที่ใช้ในทางการแพทย์
หนังสืออ้างอิง

เทคนิคในการหา DNA sequence

เทคนิคในการหา DNA sequence นั้นมีการพัฒนาขึ้นตั้งแต่ปี 1970 โดยมี 2 วิธี ด้วยกัน คือ

วิธีที่หนึ่ง พัฒนาขึ้นโดย Allan Maxam และ Walter Gilbert โดยใช้สารเคมีตัดสาย DNA ที่ตำแหน่งต่างๆ กัน วิธีนี้เรียกว่า Maxam-Gilbert sequencing ส่วนอีกวิธีหนึ่งนั้นเรียกว่า dideoxy sequencing หรือ Sanger sequencing ซึ่งพัฒนาขึ้นมาโดย Fred Sanger โดยวิธีการใช้ enzyme มาต่อสาย DNA จาก primer ในปัจจุบันวิธี dideoxy เป็นวิธีที่นิยมใช้มากที่สุด วิธีการหาลำดับเบสนั้นได้รับการพัฒนามาตลอด จนปัจจุบันนี้สามารถทำได้ง่าย และไม่ซับซ้อนยุ่งยากนัก การหาลำดับเบสนี้เป็นประโยชน์อย่างมากในการศึกษายีนต่างๆ ทั้งในคน สัตว์ และพืช โดยในคน human genome project เป็นโครงการที่จะศึกษาลำดับเบสทั้งหมดของคน ซึ่งได้เริ่มและดำเนินการติดต่อกันมาหลายปีแล้ว

Maxam-Gilbert DNA Sequencing

เป็นวิธีการที่ใช้ปฏิกิริยาทางเคมีที่จะตัดสาย DNA ที่ตำแหน่งจำเพาะ โดยที่สำคัญ DNA ที่เราจะนำมาทำการหาลำดับเบสนั้นจะต้องเป็น DNA ชนิดเดียวกัน และมีขนาดประมาณ 200-1000 bp ในตัวอย่างนี้ เราจะทำการหาลำดับเบสของสาย DNA ขนาด 10 bp

 

ขั้นตอนต่างๆ ในการหาลำดับ nucleotide โดยวิธี Maxam-Gilbert มีดังนี้ คือ

Dideoxy (Sanger DNA sequencing)

เช่นเดียวกับ Maxam-Gilbert sequencing โดยที่การหาลำดับเบสด้วยวิธีนี้ต้องการ DNA ที่เป็นชนิดเดียวกัน ซึ่งเป็น DNA สายคู่ที่จะถูก denature ให้เป็นสายเดี่ยวโดยใช้ความร้อน และ oligonucleotide สายสั้นๆ ซึ่ง complementary กับ DNA ส่วนที่ใกล้เคียงกับลำดับเบสที่เราต้องการทราบ (sequencing primer) โดยที่จะ anneal กับสาย DNA สายเดียวเท่านั้น

oligonucleotide primer จะถูกออกแบบให้ด้าน 3’ อยู่ใกล้กับส่วนของ DNA ที่เราต้องการทราบลำดับของเบส โดย oligonucleotide นี้ จะทำหน้าที่เป็น primer เพื่อให้มีการสังเคราะห์ DNA สายที่ complementary กับ DNA template ต่อไป

จากนั้น DNA ที่ anneal กับ oligonucleotide primer แล้ว (เราเรียก DNA ที่ต้องการจะหาลำดับเบสนี้ว่าเป็น template หรือ DNA template) จะถูกแบ่งเป็น 4 ส่วนแต่ละส่วนจะมี normal precursors ของ DNA เช่น dATP, dTTP, dCTP, dGTP และ DNA polymerase และ ตัว precursor นี้จะถูกติดฉลากด้วยสารกัมมันตภาพรังสี (32P) เพื่อที่จะสามารถตรวจสอบสาย DNA ที่สร้างใหม่ ใน DNA แต่ละส่วนนั้นจะต่างกันที่จะใช้ modified nucleotide คือ dideoxy nucleotide ต่างชนิดกัน dideoxy nucleotide กับ deoxynucleotide นั้น จะต่างกันที่ dideoxy nucleotide มี 3’-H ที่ deoxyribose sugar แทนที่ 3’-OH ถ้าเราใช้ dideoxy nucleotide ในขบวนการสังเคราะห์ DNA dideoxy จะเข้าไปใน สาย DNA ที่กำลังสังเคราะห์อยู่ได้ แต่สาย DNA นั้น จะไม่สามารถที่จะสังเคราะห์ให้มีความยาวต่อไปได้อีก การสังเคราะห์ DNA สายนั้นก็จะหยุด เพราะเหตุว่าการที่ไม่มี 3’-OH จะป้องกันการเกิด phosphodiester bond กับ 5’P ของ DNA precursor ตัวที่จะเข้ามาใหม่ sequencing reaction แต่ละส่วนจะมี ddATP หรือ ddCTP หรือ ddTTP หรือ ddGTP อย่างใดอย่างหนึ่งร่วมกับมี normal precursor ทั้ง 4 ชนิดคือ dATP dTTP dCTP และ dGTP ในการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ จะมีการใช้ทั้ง dd NTP และ d NTP แบบสุ่มตัวอย่าง แต่โดยทั่วไป dideoxy จะมีปริมาณ 1 ใน 100 ของ normal precursors ดังนั้นส่วนใหญ่ก็จะมีการใช้ deoxynucleotide เหมือนเช่นการสังเคราะห์ DNA ตามปกติ ซึ่ง primer ก็จะถูกต่อโดย DNA polymerase โดยมีลำดับเบสที่ complementary กับ template ถ้า dideoxynucleotide ถูก incorporate เข้าไปในสาย DNA ที่กำลังสร้างอยู่ การสร้าง DNA สายนั้นก็จะหยุดลงไม่สามารถสร้างต่อไปได้อีก ส่วนสายที่มี deoxynucleotide incorporate เข้าไป ก็สามารถสังเคราะห์ไปได้เรื่อยๆ จนกว่าจะ incorporate dideoxynucleotide เข้าไป

ดังนั้น DNA สายใหม่ที่กำลังสร้างอาจจะหยุดได้ทุกตำแหน่งที่มีการ incorporate dideoxynucleotide เข้าไป เช่น ใน ddA reaction สายใหม่ขนาดต่างๆ ที่ถูกสร้างเหล่านี้ จะมีปลายสุดท้ายเป็น ddA เสมอ ในขณะเดียวกัน ddG ddC ddT reaction ก็จะมี DNA สายใหม่ที่มีเบสสุดท้ายเป็น ddG, ddC และ ddT ทั้งสิ้น จากนั้นสาย DNA จะถูกนำมาแยกขนาด โดย polyacrylamide gel elctrophoresis แล้วนำไปประกบกับฟิล์ม x-ray ซึ่งเมื่อนำมาล้างและ develop แล้ว จะสามารถมองเห็นสาย DNA ได้โดย autoradiogram

แชร์ให้เพื่อนสิ แชร์ให้เพื่อนได้ แชร์ให้เพื่อนเลย

บ้านจอมยุทธ [เมนูหลัก]


บ้านจอมยุทธ : สร้างเมื่อ สิงหาคม 2543 วิธีใช้: อ่านเพื่อประเทืองปัญญา สรรพคุณ : แก้โง่คำแนะนำ : ควรเก็บไว้ใน Favorite หรือ ตั้งเป็นหน้าแรก | วัตถุประสงค์ |นโยบายความเป็นส่วนตัว | ติดต่อเว็บมาสเตอร์ : baanjomyut@yahoo.com : facebook