Baanjomyut.com ☰

ห้องสมุดบ้านจอมยุทธ

[ X ] ⇛ หน้าแรก ⇛ ความรู้ทั่วไป ⇛ ปรัชญา ⇛ ศาสนา ความเชื่อ ⇛ สังคมศาสตร์ ⇛ ขนบธรรมเนียม วัฒนธรรม ⇛ วิทยาศาสตร์ ⇛ เทคโนโลยี เกษตรศาสตร์ ⇛ ศิลปกรรม ⇛ ประวัติศาสตร์ ภูมิศาสตร์ ⇛ วรรณกรรม สำนวน โวหาร ⇛ สุขภาพ อาหารและยา

ค้นหาข้อมูลจากบ้านจอมยุทธ คลิก!

วิทยาศาสตร์ ดาราศาสตร์ ฟิสิกส์ เคมี ชีววิทยา >>

เทคนิคทางอณูชีววิทยา

เทคนิคพื้นฐานทางอณูชีววิทยา
Electrophoresis
Paper electrophoresis และ Gel electrophoresis
การเคลื่อนย้าย DNA จากแผ่นวุ้นลงไปบนกระดาษ (DNA Blotting)
DNA Probe และ Hybridization
Restriction Endonuclease
การเพิ่มจำนวน DNA โดยวิธี PCR (Polymerase chain reaction)
เทคนิค DNA cloning
การเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA กับ cloning vector เพื่อให้ได้ recombinant DNA
การนำ recombinant DNA เข้าสู่ host cell (transformation)
การคัดเลือก clone ที่มี gene ที่ต้องการ
เทคนิคในการตรวจสอบ DNA (DNA identification)
เทคนิคในการหา DNA sequence
เทคนิคทางอณูชีววิทยาที่ให้ผลผลิตที่ใช้ในทางการแพทย์
หนังสืออ้างอิง

เทคนิคในการตรวจสอบ DNA (DNA identification)

Southern blot hybridization

คือการ identify ส่วนของ DNA ที่ต้องการศึกษาจาก DNA รวมทั้งหมด โดยการแยกขนาดของ DNA โดยวิธี electrophoresis ในการศึกษายีนใดยีนหนึ่งโดยเฉพาะจาก DNA ทั้งหมดในเซลล์ กระทำได้ยาก เนื่องจากว่ายีนที่เราต้องการศึกษาจะอยู่ปะปนกับยีนอื่นๆ ถึงแม้ว่าจะทำการตัดยีนเหล่านั้นด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะแล้วก็ตาม แต่ด้วยการใช้สารกัมมันตภาพรังสี ทำให้เราสามารถที่จะศึกษายีนที่สนใจได้ แม้ว่ายีนนั้นจะอยู่ปะปนกับยีนอื่น หรือ ยีนนั้นมีอยู่ในปริมาณที่น้อย วิธีการคือ นำ DNA ทั้งหมดที่สกัดได้จากเซลล์มาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ และนำมาแยกออกจากกันตามขนาดของ DNA ที่ตัดแล้ว โดยใช้วิธี agarose gel electrophoresis จากนั้นทั้ง probe (ตัวตรวจสอบ) และ DNA ที่ต้องการศึกษาจะต้องถูกทำให้เป็น single-stranded DNA เสียก่อน จากนั้นนำ single-stranded probe และ DNA ที่ต้องการศึกษามา reanneal กัน (นิยมเรียกการนำ DNA สายเดี่ยวที่ติดสลากมาทำการ reanneal กับ DNA สายเดี่ยวที่เป็นเป้าหมายว่า hybridization) จากนั้น DNA สายผสม (radioactive duplex molecule) ระหว่าง DNA probe ที่ถูกติดสลากด้วยสารกัมมันตภาพรังสี กับ DNA ส่วนที่เราต้องการศึกษา จะถูกตรวจสอบต่อไปในห้องปฏิบัติการ

เทคนิคนี้ถูกนำมาประยุกต์ใช้ในงานหลายชนิด เช่น การทำ Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPs) เพื่อที่จะ map ยีนที่ทำให้เกิดโรคต่างๆ เช่น โรคทางพันธุกรรม โดย mutation ที่เกิดจะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของ restriction site โดยอาจจะเกิด restriction site ในตำแหน่งซึ่งปกติจะไม่เกิดถ้าไม่มี mutation ที่ตำแหน่งนั้น เป็นต้น ถ้าเกิด mutation แบบนี้จะทำให้ restriction fragmentation pattern หลังจากแยกขนาดโดยใช้วิธี electrophoresis นั้น เปลี่ยนแปลงไป ซึ่งเราจะค้นพบได้โดยการทำ southern blotting และ hybridize ด้วย DNA probe ซึ่งมีลำดับเบส complementary กับส่วนของยีนที่เราสนใจ

DNA Polymorphism

Polymorphism ใน genome ทำให้ความสำคัญของการใช้เทคนิคทางอณูชีววิทยาในทางการแพทย์มีเพิ่มขึ้นอย่างมาก polymorphism คือ ความแตกต่างในลำดับเบสของ DNA นั้นๆใน genome ของคน ความแตกต่างของลำดับเบสใน genome นี้มีอยู่หลายล้านตำแหน่ง ซึ่งอาจเป็นผลเนื่องมาจากการเกิด point mutation, การแทนที่ของเบส รวมถึงการขาดหายไปในบางส่วนของยีน หรือการเพิ่มเบสเข้าไปในยีนนั้น ตำแหน่งที่เกิด polymorphism นั้น อาจเกิดในบริเวณของยีนที่ถอดรหัสให้โปรตีน หรือเกิดขึ้นในบริเวณที่ไม่มีรหัสของยีนก็ได้ ลำดับเบสซึ่งแตกต่างกัน (โดยทั่วไปเป็นการเปลี่ยนแปลงเบสคู่เดียว) ในแต่ละคน จะเกิดขึ้นหลายร้อยคู่เบสต่อหนึ่งครั้งโดยเฉลี่ย โดยที่ความแตกต่างในลำดับเบสนี้จะเกิดในบางส่วนของ genome เท่านั้น แต่ในส่วนนั้นแต่ละคนจะมีคู่เบสบางคู่เบสที่แตกต่างกันเสมอ

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

เป็นวิธีที่ใช้หลักการของ sequence polymorphism ซึ่งเกิดขึ้นในยีนของคน (และในยีนของสิ่งที่มีชีวิตอื่นเช่นกัน) คือ ในบางครั้ง polymorphism หรือ mutation ที่เกิดขึ้นใน genome นั้น ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงต่อ restriction site ของเอนไซม์ตัดจำเพาะได้ เช่น เดิมยีนในตำแหน่งนี้ไม่สามารถตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดนี้ได้ แต่เมื่อเกิดมี mutation มี polymorphism ขึ้น อาจทำให้ยีนในบริเวณดังกล่าวสามารถถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกันนี้ได้ หรืออาจจะเกิดขึ้นในทางกลับกันคือ เดิมยีนส่วนนี้อาจถูกตัดด้วยเอนไซม์ได้ แต่เมื่อเกิดมี mutation ขึ้น ทำให้ไม่สามารถถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัวเดิมได้ เป็นต้น จากลักษณะนี้เองทำให้สาย DNA ของยีนที่สกัดจากคนที่ส่วนนี้ถูกเอนไซม์ตัดได้ จะมีขนาดเล็กกว่าสาย DNA ของยีนเดียวกันนี้ที่สกัดจากคนที่มีส่วนนี้ที่ไม่สามารถตัดด้วยเอนไซม์ชนิดเดียวกันนี้ได้ ความแตกต่างในความยาวของสาย DNA ชนิดเดียวกันที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดเดียวกันที่เรียกว่า RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) เกิดขึ้นเนื่องจากเกิดการเปลี่ยนแปลงของเบสบางเบสในสาย DNA นี้ ดังนั้นเมื่อนำ DNA ส่วนนั้นมาทำการย่อยด้วย restriction enzyme ก็จะให้ pattern ที่ต่างกัน ในบางครั้ง mutation ที่เกี่ยวข้องกับการทำให้เกิดโรค อาจจะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงความสามารถในการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะได้ ทำให้เราสามารถนำเทคนิคนี้มาช่วยในการตรวจหา mutation ที่ทำให้เกิดโรคชนิดนั้นๆ ได้

 

Repetitive DNA sequences

ในบางตำแหน่งบน genome ของคน จะมีลำดับเบสที่มีลักษณะซ้ำๆกันมาเรียงต่อกัน (tandem repeat) และลำดับเบสที่ซ้ำๆกันและมาเรียงต่อกันนี้ อาจจะซ้ำกันในจำนวนที่เป็นเท่า เช่น มีลำดับเบสนี้ 50 เท่า คือ มีลำดับเบสนี้จำนวน 50 ชุดมาเรียงต่อกัน บริเวณที่มีลำดับเบสที่ซ้ำกันเป็นชุดๆและมาเรียงต่อกันนี้เรียกว่า hypervariable region เพราะเหตุว่าบริเวณนี้มีความแตกต่างในจำนวนชุดของลำดับเบสที่ซ้ำกัน (variable number of tandem repeat; VNTR) การนำเอนไซม์ตัดจำเพาะมาตัดตรงตำแหน่งข้างๆบริเวณ VNTR นี้ จะทำให้ได้ขนาดของสาย DNA ของยีนที่ตัดได้แตกต่างกันขึ้นอยู่กับจำนวนชุดที่ซ้ำกัน ถ้าจำนวนชุดที่ซ้ำกันในบริเวณนี้มีมาก ก็จะให้สาย DNA ที่มีขนาดใหญ่กว่าที่มีจำนวนชุดที่ซ้ำกันน้อย

แบบแผนของขนาดของสาย DNA ที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะที่เกิดขึ้นนี้ สามารถนำไปใช้ในการตรวจค้นบุคคลได้ เหมือนกับการตรวจลายพิมพ์นิ้วมือ เทคนิคนี้จึงสามารถเรียกอีกอย่างหนึ่งได้ว่า “DNA fingerprinting” และนิยมนำมาใช้เป็นอย่างมากในทางนิติเวชวิทยา ญาติพี่น้องกัน จะมีลักษณะของ DNA fingerprinting ใกล้เคียงกันมาก แต่จะไม่เหมือนกัน ยกเว้นฝาแฝดไข่ใบเดียวกันเท่านั้นที่จะมี DNA fingerprinting เหมือนกันทุกประการ

DNA Fingerprinting

เป็นวิธีที่ใช้หลักการของ sequence polymorphism ซึ่งเกิดขึ้นในยีนของคนเช่นกัน สำหรับ genomic DNA sequences ที่นิยมใช้ใน DNA fingerprinting นี้ โดยทั่วไปจะเป็นบริเวณที่ประกอบด้วยลำดับเบสซ้ำๆกัน (เป็นลำดับเบสสั้นๆ แต่ซ้ำกันเป็นพันๆครั้ง) ซึ่งจะพบได้บ่อยใน higher eukaryotes genome และจำนวนครั้งที่ซ้ำกันนั้นจะไม่เท่ากันในแต่ละคน (ยกเว้นสำหรับใน identical twin) ถ้าเลือก probe ที่เหมาะสม pattern ของ band ที่ได้ในการทดลองจะแตกต่างกันในแต่ละคน

ในทางนิติเวชวิทยา หลักฐานที่จะนำมาทำการตรวจสอบจะมีจำนวนน้อยมาก อาจจะไม่พอสำหรับการตรวจสอบด้วยกรรมวิธีด้งกล่าว แต่เนื่องจากปัจจุบันนี้เรามีเทคนิค PCR ทำให้เราสามารถที่จะทำการทดสอบจากหลักฐานที่น้อยมาก เช่น จากเส้นผม หรือคราบเลือด ที่อยู่ในสถานที่ก่อคดีอาชญากรรมได้ (รูปที่ 14.15)

DNA sequencing

ในการศึกษายีนนั้น การหาลำดับเบสของสาย DNA นั้นๆ มีความสำคัญและเป็นประโยชน์มาก เช่น ทำให้รู้ว่า ยีนนั้นเป็นยีนอะไร หรือเพื่อที่จะเปรียบเทียบลำดับของเบสของ DNA สายนั้นในสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันและต่างชนิดกัน เป็นต้น

แชร์ให้เพื่อนสิ แชร์ให้เพื่อนได้ แชร์ให้เพื่อนเลย


บ้านจอมยุทธ : สร้างเมื่อ สิงหาคม 2543 วิธีใช้: อ่านเพื่อประเทืองปัญญา | วัตถุประสงค์ | ติดต่อ : baanjomyut@yahoo.com